INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
Campos, Ayala W.
FRACCIONAMIENTO CELULAR
FUNDAMENTO TEÓRICO:
El fraccionamiento
celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología de organelos
fueradel ambiente complejo de la célula intacta. El objetivo
principal de este experimento es aislar los cloroplastos, núcleo y
mitocondria del tejido de plantas por el método de fraccionamientocelular.
Los otros objetivos son examinar esas fraccionesmicroscópicamente y
estimar elcoeficiente de sedimentación de los cloroplastos.
HOMOGENIZACIÓN
Para
preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender
en unmedio apropiado (una solución amortiguadora, salina ó
azúcar isotónica). Para mantener laintegridad de los organelos y
enzimas durante el procedimiento de la fraccionación , todas lassoluciones y
cristalería debe mantenerse frías. Después de rebanar las hojas, el tejido
estápreparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces
celulares y libera elcontenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La
suspensión de células constituyentesse llama homogenado. Para los tejidos de
plantas, la homogenización se debe realizar con unmortero (fig.1), al cual se
le añade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos seaislarán de
la espinaca; núcleos y mitocondria se aislarán de la coliflor.
CENTRIFUGACIÓN
Debido a las
diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a
unafuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como
fuerza centrífugarelativa (RCF)en unidades de g. La RCF es una
función de velocidad de centrifugación enrevoluciones por minutos (rpm) y la
distancia de partículas desde el eje de rotación.Conociendo esta distancia (x)
y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación: RCF =1.19 x 10-5
(rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación
hastael margen de afuera del tubo de centrífuga.
CENTRIFUGACION
DIFERENCIAL
En la
centrifugación diferencial, el homogenado es centrifugado
repetidas veces a altasvelocidades, sedimentándolo
progresivamente en pequeñas partículas. El método estáilustrado en la fig. 2.
La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta
lafracción nuclear. Este ³pellet´ contiene el núcleo, células intactas y
tejido.. L próxima separaciónes el sobrenadante postnuclear ó partículas
suspendidas en líquido sobre el ³pellet´ nuclear, elcual es tranferido a
otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos en
unacentrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fracción
mitocondrial; éstecontiene mitocondria y micro cuerpos.Los cloroplastos de las
células de espinaca se aislarán utilizando el método modificado de F.RWhatley y
D.I.Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal.
Despuésque el tejido de la planta se macera en un mortero, el homogenado se
filtra a través de unagaza para remover los pedazos grandes de tejidos. El
filtrado es centrifugado a 200 g por 1minuto. El sobrenadante se
centrífuga a 1300 g por 5 minutos, sedimentando los clorosplastos.La
fracción nuclear y mitocondrial de las células de las células de la coliflor se
obtendránutilizando una centrifugación diferencial escrita por W.D. Bonner
(1967). El tejido sehomogeniza en una solución amortiguadora de mannitol.
Después se la filtración a través deuna gaza, el homogenado es centrifugado
como se ilustra en la fig. 2, paso 3
PROCEDIMENTO
Finalizada la
centrifugación, decantamos el sobrenadante a 3 tubos eppendorf marcados con
lapalabra citosol y almacenamos a ±20ºC. Lo que nos queda en el pellet es la
fracciónmicrosomal y la resuspendemos en 250 microlitros de solución
sacarosa-TRIS y almacenamos. Ahora observaremos la fracción nuclear. Para
ello hacemos un frotis con una gota del tubomarcado con núcleo. Le echamos
hematoxilina y dejamos durante 2 minutos. Lavamos conagua caliente,
colocamos un cubre y observamos.Observación de mitocondrias. Tomamos 200
microlitros de la fracción mitoncondrial del tubomarcado con mitocondrias
y añadimos 300 microlitros de tampón TRIS-HCL y 500 microlitrosde verde Jano
0,1%, de manera que estamos diluyendo la fracción mitocondrial 5 veces.Hacemos un
frotis y observamos al microscopio óptico. Vemos cantidad de esferas y
ovoidesque deben corresponder a mitocondrias, lisosomas y peroxisomas. Pero es
imposible poder diferenciar la ultraestructura.Para hacer un recuento de
las mitocondrias, hacemos uso de un hemocitómetro. Colocamos uncubreobjeto
sobre el aparato. Éste posee dos huecos a los lados del cubre, de manera que
se inyecta la suspención con colorante en esas huecos que luego pasa por debajo
del cubre y sellena la cámara por capilaridad. Y observamos al microscopio
óptico para hacer recuento.EL hematocitómetro posee bajo el cubre una zona
cuadriculada, de manera que hace fácil elrecuento de los orgánulos. Cada
cuadrícula representa 0,1 mm cúbico, es decir, 0,0001 cm a lacuarta. 1cm
cúbico=1m
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
no obtuvimos ningún resultado
BIBLIOGRAFIA
